随着mRNA疫苗和疗法的蓬勃发展，其生产工艺已成为行业焦点。与单克隆抗体相比，mRNA分子量大、负电荷高、稳定性差，并且经过酶催化转录后的产物中包含较多副产物和残留物，如流产性转录本、双链RNA（dsRNA）、转录模板DNA、酶、未反应的核苷酸（NTPs）等[1]，对纯化工艺提出了独特挑战。本文将系统解析mRNA下游纯化的核心策略、技术难点及解决方案，确保终产品满足高纯度、高完整性与低杂质残留的严苛要求。
生物制品工艺开发的核心目标在于构建稳健可控的生产工艺体系，确保可重复制备出符合预设质量属性的产品。对于mRNA而言，其关键质量属性主要包括：
• 纯度与完整性：需有效去除截短、断裂或降解的mRNA片段，确保全长mRNA的占比，这是其翻译出功能蛋白的基础。
• 杂质残留：包括体外转录反应后残留的流产性转录本、质粒DNA模板、未反应的核苷酸、双链RNA杂质、以及酶等。这些杂质可能引发不必要的免疫反应或影响产品稳定性。
• 无菌与内毒素：作为直接注入人体的药物，必须确保产品无菌且内毒素含量极低。
Table 1. mRNA疫苗关键质量属性[2]
典型的mRNA下游纯化工艺主要包含三个核心步骤，环环相扣，逐步精制。
亲和层析是mRNA纯化的首选捕获步骤，其核心是利用Oligo dT填料配基与mRNA 3’端的PolyA尾巴之间的特异性碱基互补配对在适宜的高盐缓冲液中进行结合，而绝大多数杂质如蛋白质、DNA、未掺入的NTPs等因不结合而随流穿液被去除。随后通过低盐或去离子水洗脱，即可获得高纯度的mRNA产品。
• 难点：填料载量、PolyA尾巴长度变异、对高盐缓冲液的依赖。
• 优化：筛选高载量、高稳定性的Oligo dT填料；优化缓冲液条件以平衡回收率与纯度。
经过亲和捕获后，mRNA产品中仍可能残留少量关键杂质，如双链RNA、截断的mRNA和残留的DNA。此时需引入精细纯化步骤。
• 反相层析或疏水层析：mRNA分子的碱基基团具有一定的疏水性，基于dsRNA与ssRNA在疏水性上的差异，可有效分离二者。该方法能显著降低dsRNA杂质含量，提高mRNA产品的翻译效率并降低免疫原性风险。
• 阴离子交换层析：由于mRNA骨架中含有大量的磷酸基团，带有较强的负电荷，依据电荷差异进行分离，能有效去除mRNA聚集体、酶残留等杂质[3]，例如耀海生物在专利中公开了一种mRNA的纯化方案，在氯化锂沉淀+Oligo dT亲和层析纯化的基础上，采用DEAE阴离子层析，可有效去除dsRNA杂质[4]。
• 凝胶过滤层析：mRNA与DNA模板、酶、NTPs等杂质之间存在分子量的差异，使用75PG分子筛填料可以从体外转录产物中分离mRNA，DNA模板最先洗脱，随后是mRNA，最后是NTPs和流产性转录本，mRNA的纯度可以达到99%以上，但是此方法仅限于实验室分离，且需要将体外转录混合物预先经过苯酚/氯仿提取处理，有机溶剂的引入在GMP生产环境中是严格限制的[5]。
超滤/透析是最终制剂前的关键步骤。通过选择合适截留分子量的超滤膜（通常为100-300 kDa），可以实现：
• 浓缩：将mRNA溶液浓缩至目标浓度。
• 缓冲液交换：将mRNA置换到稳定的制剂缓冲液中，去除前一步残留的盐分和有机溶剂。
• 去除小分子杂质：进一步去除可能残留的极微量小分子杂质。
mRNA药物的纯化是一场针对其分子特性的“定制化”精制过程。为实现高纯度、低杂质、高完整性的目标，下游工艺需采用多步协同的纯化策略：
• Oligo dT亲和层析作为核心捕获步骤，实现从粗制混合物中的高效特异性捕获。
• 反相/疏水层析、阴离子交换等精细纯化步骤，专注于去除dsRNA等关键杂质，提升产品质量。
• 超滤/透析作为最终步骤，完成产品的浓缩、换液，为稳定的制剂产品做准备。
通过这三步曲的精密配合，才能将体外转录的粗制mRNA，成功转化为能够精准发挥治疗作用的生物医药利器。
[1] Mu, Xin , et al. "An origin of the immunogenicity of in vitro transcribed RNA." Nucleic Acids Research 46.10(2018).
[2] US Pharmacopeia. Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality[EB/ OL]. https://www.usp.org/mma, 2022.
[3] Feng, X. , et al. "Messenger RNA chromatographic purification: advances and challenges." Journal of chromatography, A: Including electrophoresis and other separation methods (2023):1707.
[4] 江苏耀海生物制药有限公司. 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用[P].
[5] Baronti, Lorenzo , et al. "A guide to large-scale RNA sample preparation." Analytical and Bioanalytical Chemistry 410.14(2018):3239-3252.
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