糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。中国糖尿病病人数量在1.1亿左右,其中20%~30%的糖尿病病人需要通过注射胰岛素来控制血糖。
目前胰岛素主要是以基因工程手段合成,再通过一系列方法提纯得到胰岛素产品,这其中色谱技术应用最为广泛。
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受一些物质刺激而分泌的一种蛋白质激素。这些物质可以是内源性的,也可能是外源性的,比如胰高血糖素、核糖、乳糖、精氨酸等。胰岛素是通过促进糖原、脂肪及蛋白质的合成而降低血糖浓度,并且是机体内唯一一种可以降低血糖的激素。
Fig. 1 胰岛素结构示意图
Fig. 2 胰岛素类似物区别表
目前临床使用的胰岛素有三种来源:
1)动物胰岛素:从猪和牛的胰腺中提取,两者药效相同,但与人胰岛素相比,猪胰岛素中有1个氨基酸不同,牛胰岛素中有3个氨基酸不同,因而易产生抗体。
2)半合成胰岛素:将猪胰岛素第30位丙氨酸,置换成与人胰岛素相同的苏氨酸,即为半合成人胰岛素。
3)重组人工胰岛素:利用生物工程技术获得的高纯度的生物合成人胰岛素,其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
综上可见,第三种方法是目前最好的方法,副作用最小,而且简单安全。所以本篇文章针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。
已知的三种分子设计纯化工艺概括如下:
以动物胰脏为原料提取胰岛素——酸醇提取法。
● 传统胰岛素——猪、牛胰脏提取,只经一步重结晶
● 单峰胰岛素——凝胶过滤纯化
● 单组分胰岛素——凝胶过滤、离子交换纯化
半合成胰岛素——以猪胰岛素为原料,酶修饰后得到人胰岛素。
酶促修饰法又称猪胰岛素的酶转化法:
无色杆菌(Achromobacter Lyticus)蛋白酶可特异性催化胰岛素B链羧基末端(第30位上)的氨基酸置换反应,由猪胰岛素第30位上的丙氨酸(Ala)变为人胰岛素的苏氨酸(Thr)。在无色杆菌蛋白酶的作用下,首先将猪胰岛素B30位上的丙氨酸(Ala)水解除去,生成去丙氨酸-B30的猪胰岛素,在同一酶的作用下使之与苏氨酸丁酯偶联,然后用三氟乙酸(TFA)和苯甲醚除去丁醇即得人胰岛素。
以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接,形成融合基因,分别在大肠杆菌中表达A链和B链,然后再通过化学氧化作用,通过二硫键连接起来。
Fig. 3 AB链合成法工艺流程
Fig. 4 AB链合成法
通过胰岛素原的cDNA合成,表达产物是胰岛素原,经工具酶切开,除去C肽,得到人胰岛素。
Fig. 5 反转录酶法工艺流程
Fig. 6 反转录酶法
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