早在 19 世纪 40 年代，科学家们发现一种可以在细胞之间互相转移的细胞质遗传因子，并提出了多种猜测，包括寄生虫、共生体、基因等。但命名始终未得到最终的确认。直到 1952 年，Joshua Lederberg 开始着手阐明这些细胞质遗传因子的分类，并首次提出了 “Plasmid” 这个名称。“Plasmid” 是 “Cytoplasm” 和 “id”（拉丁语中的 ‘it’ ）的整合体，并将其作为 “任何染色体外遗传决定因子” 的通用术语。质粒是小的环状超螺旋双链 DNA，在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传，可通过基因工程改造接入外源 DNA 作为基因载体，转入宿主细胞。
Fig.1 质粒
如今，质粒已成为生物制药领域中最重要的工具之一，可用于克隆，扩增和表达目的蛋白；也可用于病毒载体和 mRNA 的生产等领域。质粒有多种拓扑结构，包括超螺旋质粒、开环质粒、线性质粒，其中超螺旋质粒被认为是活性最高的组分，而开环质粒由于转导细胞效率较低，需要在质粒成品中严格控制其含量。
博格隆的质粒纯化三步法工艺具有稳健、高效、可放大的特点，助力您获得符合标准的高纯度质粒。
Fig.2 质粒生产流程
• 获得一定规模的高纯度超螺旋 DNA（ssDNA）
• 去除产品相关杂质：开环 DNA（ocDNA），质粒 DNA 聚集体（dimer，trimer，tetramer，etc.）
• 去除工艺相关杂质：HCP，HC-DNA，HC-RNA
• 控制生物负荷：内毒素，微生物
• 工艺流程稳健，可重复性好
• 可进行线性放大
• 样品准备：中空纤维浓缩后样品
• 6FF 层析目的在于快速去除大量 RNA，收率一般在 90% 以上
• Buffer：2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
• 柱高可选择 30~50cm
• 进样量控制在 15~25% CV
• 操作流速 60~120cm/h
• 收集到的流穿，超螺旋比例基本在 80% 左右
Fig.3凝胶过滤图谱
高效分离超螺旋质粒（scDNA）和开环质粒（ocDNA），去除开环 DNA，收率一般大于 80%，经过该步纯化后，超螺旋比例在 95% 左右。
Buffer A：2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA 100mM Tris, pH7.5
Buffer B：1.7M(NH₄)₂SO₄-0.3M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
层析过程：
• 碱洗：0.5M NaOH 2~3CV，静置 15~30min
• 水洗：2~3CV
• 平衡：BufferA 2~3CV，至 pH、Cond 平衡
• 上样：不超过 2.5mg/mL，保留时间不低于 3min
• 清洗：Buffer A 清洗 3~5CV
• 洗脱：Buffer B 洗脱
Fig.4 亲和层析图谱
利用高分辨率去除残留内毒素及痕量杂质，收率一般可达 80%。
Buffer A：0.4M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
Buffer B：1.0M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5
样品：亲和洗脱液与 TE Buffer 进行 1:2 稀释
层析过程：
• 碱洗：0.5M NaOH 2~3CV，静置 15~30min
• 水洗：2~3CV
• 平衡：Buffer A 2~3CV，至 pH、Cond 平衡
• 上样：不超过 2mg/mL，保留时间不低于 3min
• 清洗：Buffer A 清洗 3~5CV
• 洗脱：Buffer B 洗脱
Fig.5 阴离子交换层析图谱
为方便质粒纯化后实验结果分析，博格隆推出 Ezscreen Bestarose 6HP 预装柱，用于质粒定量分析。
Fig.6 质粒分析图谱
.png){kind=icon}
.png)
浙公网安备33048202008838号
.png)
.png)
.png)
.png)
