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质粒纯化

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质粒纯化
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质粒纯化

 

何为质粒?

早在 19 世纪 40 年代,科学家们发现一种可以在细胞之间互相转移的细胞质遗传因子,并提出了多种猜测,包括寄生虫、共生体、基因等。但命名始终未得到最终的确认。直到 1952 年,Joshua Lederberg 开始着手阐明这些细胞质遗传因子的分类,并首次提出了 “Plasmid” 这个名称。“Plasmid” 是 “Cytoplasm” 和 “id”(拉丁语中的 ‘it’ )的整合体,并将其作为 “任何染色体外遗传决定因子” 的通用术语。质粒是小的环状超螺旋双链 DNA,在宿主细胞内独立于染色体外自主复制并稳定遗传,可通过基因工程改造接入外源 DNA 作为基因载体,转入宿主细胞。

 

Fig.1 质粒

如今,质粒已成为生物制药领域中最重要的工具之一,可用于克隆,扩增和表达目的蛋白;也可用于病毒载体和 mRNA 的生产等领域。质粒有多种拓扑结构,包括超螺旋质粒、开环质粒、线性质粒,其中超螺旋质粒被认为是活性最高的组分,而开环质粒由于转导细胞效率较低,需要在质粒成品中严格控制其含量。

博格隆的质粒纯化三步法工艺具有稳健、高效、可放大的特点,助力您获得符合标准的高纯度质粒。

质粒生产流程

Fig.2 质粒生产流程

质粒生产工艺目标

• 获得一定规模的高纯度超螺旋 DNA(ssDNA)

• 去除产品相关杂质:开环 DNA(ocDNA),质粒 DNA 聚集体(dimer,trimer,tetramer,etc.)

• 去除工艺相关杂质:HCP,HC-DNA,HC-RNA

• 控制生物负荷:内毒素,微生物

• 工艺流程稳健,可重复性好

• 可进行线性放大

质粒纯化工艺

Bestarose 6FF 层析

• 样品准备:中空纤维浓缩后样品

• 6FF 层析目的在于快速去除大量 RNA,收率一般在 90% 以上

• Buffer:2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

• 柱高可选择 30~50cm

• 进样量控制在 15~25% CV

• 操作流速 60~120cm/h

• 收集到的流穿,超螺旋比例基本在 80% 左右

Fig.3凝胶过滤图谱

Plasmid 亲和层析

高效分离超螺旋质粒(scDNA)和开环质粒(ocDNA),去除开环 DNA,收率一般大于 80%,经过该步纯化后,超螺旋比例在 95% 左右。

Buffer A:2.1M(NH₄)₂SO₄-10mM EDTA 100mM Tris, pH7.5

Buffer B:1.7M(NH₄)₂SO₄-0.3M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

 

层析过程:

• 碱洗:0.5M NaOH  2~3CV,静置 15~30min

• 水洗:2~3CV

• 平衡:BufferA 2~3CV,至 pH、Cond 平衡

• 上样:不超过 2.5mg/mL,保留时间不低于 3min

• 清洗:Buffer A 清洗 3~5CV

• 洗脱:Buffer B 洗脱

Fig.4 亲和层析图谱

 

 Q Mustang 阴离子交换层析

利用高分辨率去除残留内毒素及痕量杂质,收率一般可达 80%。

Buffer A:0.4M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

Buffer B:1.0M NaCl-10mM EDTA-100mM Tris, pH7.5

样品:亲和洗脱液与 TE Buffer 进行 1:2 稀释

 

层析过程:

• 碱洗:0.5M NaOH  2~3CV,静置 15~30min

• 水洗:2~3CV

• 平衡:Buffer A 2~3CV,至 pH、Cond 平衡

• 上样:不超过 2mg/mL,保留时间不低于 3min

• 清洗:Buffer A 清洗 3~5CV

• 洗脱:Buffer B 洗脱

Fig.5 阴离子交换层析图谱

实验结果分析

为方便质粒纯化后实验结果分析,博格隆推出 Ezscreen Bestarose 6HP 预装柱,用于质粒定量分析。

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Fig.6 质粒分析图谱

质粒纯化三步法主要填料汇总

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