多特异性抗体可以同时结合多个表位，从而解锁解决以前难以治疗或无法治愈的疾病的机制，目前已成为当前生物治疗药物的重要发展方向。
然而由于其分子设计的复杂性，部分多特异性抗体对极端pH条件高度敏感，传统低pH病毒灭活工艺易导致聚体和片段等杂质的产生，从而影响产品的质量、安全性和有效性。传统的替代方法是在中性pH条件下使用有机溶剂/去垢剂（S/D）进行孵育，但这种处理方式存在一些缺陷，例如处理体积和有机溶剂/去垢剂的使用量巨大，以及使用的TnBP的毒性和环境污染问题。
因此，建立温和、高效、可工业化放大的病毒灭活策略，是pH敏感型抗体药物开发与生产的关键技术环节。
哺乳动物细胞表达体系存在内源性病毒与外源病毒污染风险，相关指导原则明确要求生物药纯化工艺需设置至少两种正交机制的病毒清除步骤。单克隆抗体常规工艺以低pH孵育作为包膜病毒灭活核心单元操作，一般置于蛋白A亲和层析低pH洗脱步骤之后。
影响低pH病毒灭活的主要因素包括pH、孵育时间、孵育温度、缓冲体系等，其中pH值则是最主要的影响因素。由于低pH对抗体类分子往往具有不利影响（如诱导抗体聚集等），该条件对多特异性抗体等pH敏感型分子存在显著局限性。
对于某些在低pH环境下不稳定的分子，无法用低pH孵育进行灭活病毒，此时则可选择有机溶剂/去垢剂（S/D）进行病毒灭活，该技术在血液制品的病毒灭活中有着长期的应用。
常用的有机溶剂/去垢剂包括TNBP、Triton X-100和PS80等。有机溶剂/去垢剂可单独或混合使用，其关键工艺参数包括灭活温度和时间等，但同时需要评估添加的有机溶剂/去垢剂对产品稳定性和质量的影响以及残留情况。
通常情况下，建议将有机溶剂/去垢剂灭活放在下游纯化的起始步骤（如向澄清的细胞培养液中添加含有1%聚山梨酯80（PS80）和0.3%磷酸三丁酯（TnBP）的S/D溶液），以便后续纯化步骤可以进行有效去除。
• 处理体积大，有机溶剂/去垢剂的使用量高。2000L的细胞培养液需要添加6kgTnBP（Toxic Products），操作风险高；
• 需配置专用混合储罐，增加厂房占用与设备投入；
• 需处理大量的有毒废液，危废处理成本高，环境与安全管理压力大。
为解决传统的S/D处理方式的缺陷，文献Viral inactivation for pH-sensitive antibody formats such as multi-specific antibodies 提出了一种改进的S/D处理方法，即在亲和柱上进行孵育。经过一系列的实验设计，包括不同下游单元操作对细胞培养液中S/D的清除效果、S/D孵育步骤在蛋白A亲和层析中不同位置的评估、病毒灭活能力的评估以及S/D柱上孵育对蛋白A亲和填料寿命的影响，在不新增单元操作的前提下，实现了病毒灭活、有机溶剂去除与产物纯化的协同优化。
TnBP作为一种具有较高毒性的化合物，目前尚未有明确的每日允许暴露量(PDE)标准。然而，若能将TnBP的浓度降至痕量水平，即不超过1 μg/mL，便可以认为其去除是有效的。这一目标相当于需要实现至少3.5 log10的去除效率。
文献中的研究方法即将0.3% w/w的TnBP和1.0% w/w的PS80的S/D溶液加入澄清后的细胞收获液中，评估蛋白A亲和层析（PA）、阳离子交换层析（CEX）、阴离子交换层析（AEX）以及超滤/渗滤（UF/DF）等下游单元操作对TnBP的清除能力。实验结果（Fig.1 ）显示，PA步骤可有效去除TnBP（即≥3.48 log10），而其他步骤的清除效率较低（均＜2 log10）。与TnBP相比，PS 80在多个工艺步骤（如PA和CEX）中均能被有效去除（＜0.0025%（w/w））。
Fig.1 不同下游纯化步骤（PA、CEX、AEX和UF/DF）对TnBP的去除率（TnBP水平通过GC-MS方法测定）
尽管CEX、AEX和UF/DF工艺步骤累积可实现有效去除TnBP（即1.05 log 10 + 1.13 log 10 + 1.78 log 10 = 3.96 log 10），如果在PA步骤之后进行S/D病毒灭活，在缺少PA步骤去除TnBP的情况下，该工艺对TnBP去除的稳健性将变差。这可能是众多生物制药平台选择在PA前对澄清的细胞收获液进行S/D处理以灭活病毒的原因之一。
尽早在PA中去除引入的TnBP不仅可以有效降低TnBP的浓度，避免其潜在毒性，还可以减少产品与TnBP长时间接触的可能性，从而保障最终产品质量。
上述研究结果显示，对澄清的细胞收获液进行S/D处理既能保证病毒灭活的效果，又可兼顾TnBP的有效去除，但是它需要消耗大量的S/D溶液，并可能导致有毒废水处理成本的增加。为了解决这些问题，该文献中又进行了在蛋白A亲和层析柱中不同位置进行S/D孵育的效果的研究。研究方案如Fig.2 所示：
Fig.2 S/D孵育在Pro A层析中的位置
(A) 在CCCF中，(B) 在样品上样之后，第一次淋洗步骤之前，(C) 在第一次淋洗步骤之后
三种方案的研究结果见Table 1：
Table 1. 三种方案的实验结果（工艺性能和产品质量）
实验结果显示，这三种方案在蛋白A亲和层析洗脱液的质量参数上基本一致。然而，方案C在洗脱液中检测到了TnBP的存在，而方案A和B中的TnBP浓度均低于检测限。因此，在澄清的细胞收获液中进行S/D孵育或在蛋白A亲和层析上样之后，第一步wash之前进行S/D孵育是更为合理的选择，因为它们能够有效地去除TnBP，同时保持产品质量的一致性。
在评估蛋白A亲和层析上进行S/D孵育的病毒灭活效果时，模型病毒的选择也至关重要，由于实验中使用的抗体由CHO细胞表达生成，因此选择鼠白血病病毒（XMuLV）进行实验研究。除此之外，需要考虑蛋白A亲和层析本身的病毒清除能力。为了独立评估S/D孵育的病毒灭活作用，本研究采用实验方案方案（ Fig.3 ）即用PBS pH 7.4对PA填料进行平衡（A）、上样（B），在S/D溶液（ PBS pH 7.4, 0.3% (w/w) TnBP, 1.0% (w/w) PS80）淋洗（C）结束之后，拆柱并回收散装填料（D），向填料中引入5% v/v的XMuLV病毒母液，并在不同的时间点（0-1，15，30，60min）进行孵育（E），通过检测TCID50来评估病毒的灭活效果（F）。
Fig.3 独立评估S/D孵育的病毒灭活作用实验方法
Fig.4展示了柱上S/D孵育病毒灭活的指数趋势。S/D孵育60min之后，病毒滴度总降低值为5.41 log 10，实现了有效的病毒灭活（LRV＞4 log10）。
Fig.4 Pro A亲和柱上S/D孵育对XMuLV的log10清除值 (LRV) 动力学曲线，病毒灭活条件为15-17℃灭活0-1, 15, 30和60 min，实线代表指数回归线，虚线代表95%置信区间 (CI)
为评估S/D柱上孵育对蛋白A亲和填料性能以及最终产品质量的影响，文献中共进行了60次S/D孵育的蛋白A亲和层析实验，通过对工艺性能属性和蛋白A亲和层析后产品质量的监测（Table 2），并在第20、40和60次运行时测定了动态结合载量（DBC）（Fig.5）来评估填料的寿命。
Table 2. 质量属性监控结果
Table 2. 中的数据表明，随着运行次数增加，TnBP的去除效率、洗脱蛋白的SEC纯度和CE-SDS纯度结果仍能保持稳定的状态。
Fig.5 (A) 不同运行次数时的DBC曲线 (B), 上样至10%穿透时计算的填料载量与运行次数的函数
Fig.5 结果显示，随着S/D孵育次数的累积，蛋白A亲和填料的10%DBC呈现出递减的趋势（从初始的34 g/L下降至第60次运行时的28 g/L）。结合Table 2的数据，可以看出，10%DBC下降可能影响收率，对产品质量影响不大。
在蛋白A亲和层析上进行S/D孵育可有效灭活病毒并去除TnBP。除此之外，该方法解决了传统低pH灭活蛋白纯度下降风险，与传统S/D灭活方法相比，同时也改善了试剂用量大、操作风险高的缺陷，是一个有效的工艺替代方案。
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