各位小伙伴，是否有过某个填料在实验室鏖战多次装柱，反反复复、燃尽了自我，还未得到合格柱效的苦恼？实验室层析柱的装填可是一个精细活儿。今天，让我们从博格隆BXK实验室型层析柱的装填出发，畅谈装柱妙法。
BXK实验室型层析柱是为广大小伙伴们精心设计的低压层析柱，内管直径涵盖16/26/50 mm，层析柱由高硼硅玻璃内管、亚克力外管和POM塑料配件等组成。BXK实验室型层析柱具有良好的生物相容性和化学耐受性，适合绝大部分水性溶液。同时，其管路不易弯折，柱头液流分布均匀，高流速下也容易装出高柱效的层析柱。
Fig.1 BXK系列实验室型层析柱
BXK层析柱主要由三部分组成：柱管、上柱头、下柱头。
• 柱管：柱管为双层设计，内管材质为高硼硅玻璃，外管材质为亚克力；外管有保护内管和提供夹套层可以通水浴保温的作用。柱管长度有20 cm、30 cm、40 cm、60 cm、70 cm、100 cm等不同规格。
• 上柱头：由堵头、软管、调整旋钮、柱头固定器、柱头螺旋杆、密封圈、柱塞头、支撑网、筛网等组成。
Fig.2 BXK系列实验室型层析柱上柱头结构
• 下柱头：下柱头结构与上柱头类似，柱头螺旋杆缩短，无调节柱高能力。考虑到纯化实验对不同柱高的需求，特别推荐使用BXK Plus系列层析柱，上下柱头均配备有较长的柱头螺旋杆，装柱高度具有好的适配性。
• 装柱器：由上盖、亚克力管、连接器等部件组成，是层析柱的一个配件，用于装填较高柱床时使用。
Fig.3 BXK系列实验室型层析柱装柱器（配件）
• 装柱前需要先检查上、下柱头的柱塞头与柱头螺旋杆是否拧紧，装柱器亚克力管与连接结构是否拧紧，以防出现漏液情况；
• 使用BXK Plus层析柱装柱时，其底部柱头的锁定位置，需要根据胶悬液体积和最终上柱头大概的锁定位置提前规划确认，避免胶悬液无法全部装入柱管或者上柱头下压距离无法达到目标位置。而层析柱的可装柱柱高范围由柱管长度、柱头最低最高锁定位置决定，可在空柱状态进行操作确认；
• 已使用次数较多的柱子，建议超声清洁上、下筛网或者更换新的筛网，防止液流分配异常导致装柱柱效出现双峰等情况；
• 亚克力外管不可接触20%浓度以上的乙醇等有机溶剂，接触后受自身应力或外力影响存在开裂风险;
• 层析柱出现漏液一般是柱塞头与柱头螺旋杆的连接、密封圈与柱管壁之间的密封出现问题，可以尝试将其重新拧紧进行处理，但应注意防止拧紧力度过大导致柱塞头开裂等异常情况。
实验室层析柱装填可能会用到的缓冲液有纯化水、20%乙醇、低浓度NaCl溶液和终浓度20%乙醇+0.4 M NaCl的特殊装柱缓冲液。在不同缓冲液中，琼脂糖基球填料的分散性、压力和沉降速度有所不同。
• 纯化水是最常用的装柱缓冲液，适合绝大多数场景；
• 在20%乙醇的装柱缓冲液中，填料所受压力更大，沉降最快，同时填料会有一定收缩，使得整体装填更紧密，使用压力略增大，但不易塌柱，柱效更高；
• 在低浓度NaCl溶液中，填料分散性更好，沉降速度慢，沉降高度更高，容易柱效拖尾，但很适合用于装填有轻微结块难以分散的旧填料。
• 20%乙醇+0.4M NaCl溶液适合装填Diamond基球填料，使其在直径50mm以下柱型的装填中有更好的对称性表现。
切记在装柱时，需要先将填料从保存液中完全置换到装柱缓冲液中。
填料量、胶悬液浓度、装柱流速、压缩系数是影响装柱效果的几个填料相关因素。
• 填料量我们根据目标柱高、填料压缩系数可以计算得到装柱所需填料体积，但是更需要确认的是胶悬液中的实际填料体积。实际填料体积有多种确认方法，新填料的实际体积可以根据供应商提供的未拆封填料的胶悬浓度（博格隆填料胶悬液浓度为80%）乘以所取出的已充分混匀的胶悬液体积进行直接计算，也可以让填料在20%乙醇或者纯化水中过夜静置沉淀（最准确）、在重力柱中排掉保存液或者1000 rpm离心10 min左右后进行测量。
• 装柱胶悬液浓度推荐40-70%之间，过高的胶悬液浓度会导致填料难以混匀，装柱出现双峰等异常情况。
• 装柱流速根据不同的基球和粒径有所不同，在设备条件允许下应大于工艺流速。如果采用装柱器进行装柱，常采用两步流速进行装柱，一般移除装柱器后的第二步流速大于工艺流速，第一步流速可以采用第二步流速的30-50%。以下是博格隆填料实验室层析柱装柱推荐流速：
Table 1. 博格隆填料实验室层析柱装柱推荐流速
• 压缩系数在采用装柱缓冲液为纯化水、20%乙醇或者终浓度20%乙醇+0.4M NaCl的条件下，通常博格隆琼脂糖基球填料在26 mm、50 mm层析柱上可采用1.15压缩系数，聚合物基球填料采用纯化水装柱该类柱型使用1.07压缩系数。对于直径更小的层析柱（6.6 mm-16 mm），其柱壁支撑效应太强，采用更低的压缩系数即可达到较为对称的柱效。
下面我们以AT Protien A Diamond Ultra填料装填BXK 16/40 Plus柱（双上柱头结构）,目标柱高18 cm为例进行装柱。
装柱缓冲液我们选择20%乙醇+0.4 M NaCl，无需使用装柱器。填料初始胶悬液浓度80%，压缩系数因为层析柱直径16 mm，可采用1.13左右压缩系数。所需填料40.9 ml（3.14159×0.8×0.8×18×1.13），胶悬液51.1 ml（40.9÷80%）。
• 首先检查筛网洁净状态，检查上、下柱塞头是否拧紧，用纯化水清洁层析柱。
• 将下柱头锁定在距离下柱管底部7 cm处，倒入装柱缓冲液10 ml，用注射器从下端管路抽液排走下筛网气泡，柱中剩0.5 cm高度的装柱缓冲液，拧紧层析柱下端管路堵头。
• 将上柱头连接层析系统，流速设定5 ml/min，使用注射器吸走上筛网气泡后暂停流速。
• 将51.1 ml胶悬液采用玻璃棒引流倒入柱中，用装柱缓冲液补满层析柱，放入柱管拧紧密封圈密封锁定。
• 打开层析柱下端堵头，下端管路不连接层析系统，设定流速10 ml/min，换液1.5-2 CV。
• 换液完成后，将填料用装柱缓冲液冲出层析柱，胶悬液浓度调整到67%左右，胶悬液体积61 ml。
• 清洁层析柱，重新进行上、下筛网排气泡操作。
• 将胶悬液充分混匀！！！玻璃棒引流倒入柱管内，用装柱缓冲液补满层析柱。
• 将上柱头调整到最低入管位置，以液液接触的方式倾斜45°将上柱头放入柱管，避免产生气泡，拧紧上柱头螺杆旋钮使上柱头垫圈膨胀密封锁定。
• 打开层析柱下端堵头，下端管路不连接层析系统（防止因为层析系统柱后管路压力过大，导致填料受压过高，影响压柱距离判断）。
• 设定流速13 ml/min（400 cm/h左右），恒流压柱10-15 min(确保胶面不再下降，柱前压稳定)，标记稳定的胶面位置。
• 随后停止流速，拧紧层析柱下端管路堵头，上端管路打开不连接层析系统，将上柱头密封圈调整到半密封状态，准备进行压柱，液体将从上柱头管路排出。
• 在填料量非常准确，并且操作过程无明显损失填料的情况下（如胶悬液量取、转移过程、上柱头放入柱管过程），可以将柱头匀速下压到18 cm处，随后拧紧上柱头完成装柱。但在实际操作16 mm及更小直径层析柱时，往往可能因为层析柱直径小，填料的体积称量不准会对柱高影响较大以及操作过程中损失填料也明显影响柱高，因而如果还是按照事先确定目标高度直接压柱，就可能无法达到非常理想的柱效。因此下压操作实际场景可以根据经验进行：在采用本文推荐的装柱缓冲液和流速装柱的场景下，20 cm左右的标记高度，可下压到标记高度以下1-1.5 cm的形式完成压柱，多数填料能得到理想的柱效结果。如果需要严格按照压缩系数进行装填，可以先用30-60 cm/h流速进行沉降，确认填料沉淀高度，再进行高流速步骤，但某些填料在低流速沉降后装柱效果不好。
建议采用NaCl柱效测试法，与生产规模层析柱保持一致。通常0.4-0.5 M NaCl作为平衡缓冲液，0.8-2 M NaCl作为上样液，上样体积1-2% CV，上样及后续流速采用30-60 cm/h。对于柱效要求，建议可根据实际需求进行制定，一般理论塔板高度小于3-5倍颗粒粒径，AS保持在0.8-1.8能满足绝大多数层析柱效需求。而对于流穿模式、亲和模式层析，可适当降低柱效要求。
值得注意的是，如果采用高流速如150 cm/h进行柱效测试，琼脂糖填料柱效会明显比低流速场景低，因此相应的柱效要求也应该降低；如果采用差异极大的平衡和上样盐浓度，如0.15 M+2 M的组合，在高柱高或者清洁未到位的填料场景下，可能会导致柱效结果异常。
各位小伙伴们，希望以上经验分享能够对大家的实验室层析柱装柱过程有所助力，装柱过程中如需帮助，请咨询博格隆技术工程师。
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