如何实现高效慢病毒纯化？关键工艺与策略解析

2024,10, 24

博格隆

引言

慢病毒（Lentivirus，LV）作为一种优秀的病毒载体，被成熟运用于细胞免疫治疗中，尤其是在Car-T疗法中的广泛运用，为肿瘤和免疫疾病的治疗带来了新的方向。

慢病毒来源于人免疫缺陷病毒，是逆转录病毒的一种。它通过将外源基因整合到宿主基因序列中，可以实现外源基因的稳定表达。目前使用的慢病毒经过科学家对膜蛋白的改造、去除复制相关基因和毒性基因等操作，获得较高的安全性和广泛的宿主感染能力，同时具有本身装载容量大、可实现稳定外源基因表达的特点。

慢病毒的性质

慢病毒的结构和特性使其在基因治疗中具有独特优势，但同时也对生产和纯化提出了挑战：

• 单链RNA病毒

• 细胞裂解型

• 直径80~120nm

• 装载容量：最大9kb左右

• 包膜结构：对低pH、高温、剪切力及盐浓度敏感

慢病毒生产工艺

目前，慢病毒的生产通常通过质粒转染HEK 293细胞进行贴壁/悬浮培养，其工艺流程包括以下几个步骤：HEK293细胞培养、澄清、核酸酶处理、超滤浓缩、层析纯化、超滤换液和除菌过滤。

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Fig.1 慢病毒生产工艺流程

慢病毒的活性需要依靠完整的包膜结构，但其包膜上的某些糖蛋白对高温、剪切力、盐浓度都敏感，包膜容易受到破坏导致病毒失活。

因此，在生产过程中要注意条件控制，例如超滤环节可采用300~750KD中空纤维柱，有效降低剪切力和压力，控制剪切力＜4000/s-1，TMP为3~7psi，浓缩5~10倍。在层析步骤，要注意减少慢病毒与高盐条件的接触时间，适当添加稳定剂。慢病毒体积较大，采用0.22μm滤器进行除菌过滤收率一般只有60%~70%，为提高收率，生产过程可采用无菌生产工艺。对于工艺过程中慢病毒的回收率，需要重点考察感染滴度回收率，可采用QPCR或FACS法检测感染滴度。

慢病毒的纯化策略

在层析纯化之前，慢病毒通常经过核酸酶处理和过滤去除部分杂质。然而，HCP（宿主细胞蛋白）、HCD（宿主细胞DNA）等残留杂质仍需通过层析纯化进一步去除。根据慢病毒颗粒与杂质的大小和等电点差异，推荐使用复合模式和阴离子交换等填料进行纯化。

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Fig.2 博格隆复合模式填料（上）与阴离子交换填料（下）产品

Diamond Layer 700 是一款专为病毒和大分子纯化设计的复合模式填料。其独特的双层结构使得大分子病毒不进入孔隙，直接流过柱床，而大部分杂质则通过离子和疏水相互作用被吸附在微球内部的配基上。该填料具有操作灵活性极佳、上样量大、流速高的特点，与传统的4FF、6FF分子筛相比，效率更高。

• 应用案例：采用Diamond Layer 700纯化慢病毒，通常上样量为0.3~6 CV，病毒感染收率可达60%以上。在上游杂质较少的情况下，一步纯化即可满足质量要求。

Diamond Q Mustang 和 Diamond DEAE Mustang 是两种高分辨率的阴离子交换填料，可以用于进一步去除HCP、HCD、内毒素等杂质。虽然Q型强阴离子填料的载量高于DEAE弱阴离子填料，但因为Q填料配基的完全季氨基化，纯化过程中会对慢病毒包膜结构造成影响，其感染回收率远低于DEAE填料。因此，选择适合的阴离子填料不仅能确保产品质量，还要根据病毒的特点合理调整工艺条件。

值得注意的是，慢病毒对高盐敏感，阴离子交换纯化过程中常用的NaCl 500mM以上洗脱后需迅速稀释至200mM以下，避免对病毒结构的破坏。慢病毒在1M NaCl接触1小时后，其感染活性会损失50%左右。同时，建议在整个纯化过程中添加5%蔗糖作为稳定剂，进一步保护病毒的活性。