双特异性抗体( bispecific antibody，BsAb)是指通过基因重组实现的能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体，由于其特异性和双功能性，BsAb类药物现已成为生物制药领域的研究热点，尤其在肿瘤治疗、炎症性疾病及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景
根据是否含有Fc片段可将双抗分为IgG-like BsAb与Non IgG-like BsAb两类，由于IgG-like BsAb 含有Fc区域，因此保留了ADCC（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）与CDC （complement dependent cytotoxicity）效应，增强肿瘤杀伤效果。
然而在重组表达过程中因错配、缺失、聚集等原因产生多种产品相关副产物，包括同源抗体（homodimer Fc species）、异源抗体（heterodimeric Fc species）、抗体片段（半抗体half antibody、3/4 抗体）以及聚集体（aggregate）等。
亲和层析中与Fc片段结合的填料可通过重链恒定区Protein A结合位点数量的不同有效简化同源二聚体的去除；而不同轻链的设计可避免重链错配，但去除κλ-body中mono κ及mono λ homodimers仍需特定亲和层析过程。
离子交换层析可通过高度线性的pH梯度分离pI差异非常小的目标双抗与homodimer（0.1个pH单位）
复合模式填料同时具备电荷与疏水作用，可利用homodimer 与目标双抗疏水性以及表面电荷差异对其进行去除。
Half antibody 仅含一个Fc区，相较于含两个Fc区域的目标抗体分子来说，half antibody与亲和填料结合能力弱，比目标分子更早洗脱，可通过pH线性梯度或等度pH去除。
在适合的条件下，复合模式与离子交换模式也可有效去除half antibody， half antibody的结合力比目标BsAb弱，在线性盐梯度下，half antibody会更早洗脱。也可尝试在流动相中加入适当的PEG以增加离子交换层析的分辨率。
轻链相关杂质主要形成于轻链、重链、二硫键的断裂过程中，可以通过电荷与疏水性差异进行去除。若少一条轻链的HHL可通过Protein L去除，多一条轻链的HHLLL也可尝试在疏水性较弱的高分辨疏水填料采用结合洗脱的模式进行去除。
由于对称型的IgG-like BsAb肽链的延伸增加剧了分子间的肽链缠绕，因此更容易形成聚集体。聚集体与亲和填料的结合力相比目标分子稍强，在洗脱缓冲液中添加PEG/CaCl2或PEG/NaCl可提高分离度。
疏水层析在去除聚集体的应用上效果突出，聚集体的疏水性比单体强，疏水层析可通过目标分子流穿模式去除聚体，对于自身疏水性很强的目标分子可选用疏水性相对较弱的Octyl、Butyl填料筛选上样条件。也可选用高分辨疏水填料进行洗脱分离聚体和目标抗体。同样在选用复合模式填料与离子交换填料时时，粒径小、配基密度低的介质可提高聚体与目标抗体的分离度。
双抗的重组表达过程中副产物的产生不可避免，与常规抗体相比，bsAbs的纯化更具挑战性，有目的性地针对不同类型的杂质筛选填料与路线方能快速拉通双抗下游纯化工艺。
2025年03月20日
2025年03月18日
2025年03月13日
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