一文读懂四大核心层析原理，打牢纯化基础

凝胶过滤是一种根据生物分子的大小及形状来分离物质的层析方法。凝胶过滤介质为多孔的网状结构，生物分子越小，在介质中走过的路径越长，出峰越靠后。选择凝胶过滤介质关键在于选择合适的分离范围，其次要考虑介质的机械性能和可放大性。

Fig.1 凝胶层析术语

大分子首先离开柱子，紧接着是中分子，最后是小分子。全部分离过程需要一个全柱体积的缓冲液通过凝胶过滤柱料。

Fig.2 凝胶层析过程层析图谱

缓冲液：Tris-HCl（pH7~8）、磷酸盐缓冲液（pH6~7.5），低浓度NaCl（如150mM减少吸附）。

离子交换层析是根据不同生物分子所带表面电荷性质和数量的差异来分离的一种层析技术。由于生物分子大都带有酸性基团和碱性基团，并且可以通过调节缓冲液的pH改变其带电性质和数量，生物分子与带相反电荷的阴离子交换填料或者阳离子交换填料相结合后，采用改变流动相中的离子强度或pH，让结合弱的先洗脱下来，结合强的后洗脱下来，从而达到分离纯化的目的。

每种蛋白质都有其独特的净电荷与pH的关系，可以将其显示为滴定曲线。

注：当分子所在溶液pH小于分子的pI（等电点）时，分子表面净电荷为正（+）；当分子所在溶液pH大于分子的pI时，分子表面净电荷为负（-）。

Fig.3 蛋白滴定曲线

Fig.4 阴离子交换层析过程

• 载量高，适合工业放大

• 分离效率高，应用最广（约75%的纯化流程使用）

• 需优化pH和盐浓度

• 需高盐洗脱，不适用于高盐条件下不稳定的样品

Table 2.疏水层析功能基团

Fig.6 疏水层析过程

• 分辨率高

• “高盐吸附，低盐洗脱”的特点使其能直接与其他层析分离技术如盐析、离子交换等工艺联合使用

• 高盐易引发沉淀，需要合理控制盐浓度

• 对温度较敏感：层析开始前建议确认样品、缓冲液、柱子、层析设备都在相同的温度

• 洗脱容易拖尾

亲和层析是一种根据生物分子之间的特异相互作用来分离物质的层析方法，如酶和底物的结合、受体和配体的结合、抗体和抗原的结合等。这类结合既是特异的，又是可逆的。通过这种可逆的结合和分离来达到蛋白纯化的目的。亲和层析具有高选择性的特点，可快速从复杂体系中捕获目的蛋白，通常一步纯化就能达到90%以上的纯度。

Table 3.亲和层析常见配基与底物

Fig.7 亲和填料结构

• 特异性强，一步纯化后纯度可达90%以上

• 操作简便，适合作为第一步捕获工艺

• 填料单价相对其他层析填料较高

• 配基脱落风险需控制

层析纯化技术构建了现代生物制药工艺的“中流砥柱”，而层析填料就是这个工艺阶段的关键构件。理解层析原理，是掌握纯化技术的第一步。未来，我们还将深入解析不同类型填料的选择技巧、工艺优化思路以及真实案例分享，敬请期待！

你想了解哪种层析技术的应用细节？欢迎留言与我们互动！