疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 是蛋白质纯化技术体系中极具价值的一种分离手段。早在 1948 年，Tiselius 就提出了利用疏水相互作用进行分离的概念。与依赖分子电荷差异的离子交换层析不同，疏水层析利用蛋白质表面疏水结构差异实现分离——在高盐环境中，疏水基团之间的相互作用被增强，从而促进蛋白质与填料表面的结合。
在重组蛋白生产中，宿主细胞蛋白等杂质通常亲水性更强，而目标蛋白可能含有天然疏水结构域（如抗体的恒定区）。这种物性差异赋予疏水层析在去除特定杂质方面的天然优势。更重要的是，HIC 在工艺流程中的应用十分灵活——既可在高盐条件下作为捕获步骤，也可在中盐条件下作为中度纯化，也常用于在缓冲液条件稍作调整后与离子交换层析组合，实现精纯目的。
疏水作用层析常见的操作模式包括结合–洗脱模式和流穿模式。
• 结合–洗脱模式：工艺步骤通常包括平衡、上样、清洗、洗脱和再生。一般在高盐条件下将样品上柱，高盐环境可增强蛋白质表面疏水基团与填料的相互作用，使目标分子结合在介质上。上样及清洗后，通过逐步降低洗脱液中的盐浓度，依结合力强弱依次洗脱不同分子，从而实现分离纯化。
• 流穿模式：选择疏水性较强的填料，并在上样时不添加盐或仅添加低浓度盐，使目标蛋白与填料几乎不发生疏水作用，直接流出，而疏水性较强的杂质被填料保留，实现杂质去除。
Table 1. 疏水填料强弱应用介绍
注：填料的疏水性不仅取决于配基种类，还会受到配基密度及基质性质等因素的影响，从而改变其实际疏水强度。
• 基于疏水表面差异的分离：在高盐（如 1.0~2.0M硫酸铵等盐）条件下，疏水基团的溶剂化被削弱，蛋白更倾向与填料的疏水配基（苯基、丁基、辛基等）发生可逆结合；随后通过降低盐浓度（或加入温和添加剂）使蛋白依结合强弱顺序洗脱。
• 可有效区分电荷相近但疏水性不同的分子：（例如与目标蛋白等电点接近的 HCP）。这点与依赖电荷差异的离子交换形成互补。
• 温和洗脱，保留活性：通过降盐梯度洗脱，无需极端pH或高比例有机相（对比：RPC需高浓度有机试剂），最大限度保留蛋白天然构象和生物活性。
• 特定杂质的高效去除
○ 宿主蛋白（HCP）：疏水性较强者在高盐下结合更紧，可被选择性去除。
○ 聚集体：因疏水表面积更大，优先被吸附，洗脱晚于单体，有助于样品聚体含量控制。
○ 内毒素与核酸：在合适盐种类与缓冲条件下，HIC可一定程度降低其共洗脱，但通常需与AEX流穿/TFF联合使用以达到去除标准。
• 良好的工艺衔接与通量
○ 与离子交换/盐析无缝衔接：高盐样品或经硫酸铵沉淀处理后的样品，可在调至目标盐浓度且样品澄清（0.22μm过滤）的前提下直接上柱，减少脱盐/换液环节（是否免TFF视黏度/导电度窗口而定）。
○ 高通量友好：高刚性疏水填料（如Diamond Phenyl）具有良好的机械强度，可在较高线速度下运行，并可通过多柱切换/并联提升产能与设备利用率。
• 介质：Diamond Butyl Mustang
• 样品：经复合模式层析捕获洗脱后样品
• 流动相1：高盐Buffer，pH7.0
• 流动相2：低盐Buffer，pH7.0
• 再生：超纯水
Fig.1 某重组疫苗疏水步骤纯化层析及电泳图
实验结果
疏水层析后SEC纯度提高3%以上。
• 层析柱：BXK16/20 10cm bed height, CV=20mL
• 介质：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub)
• 样品：酵母培养上清，加入0.5M硫酸铵
• 样品体积：450ml (22.5 c.v.)
• 流速：300cm/h (loading) 60cm/h (elution)
Fig.2 某重组蛋白疏水纯化层析图谱
• 介质：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub)
• 样品： 用0.22μm滤膜过滤后
• 流动相1：高盐Buffer pH7.2
• 流动相2：低盐Buffer pH7.2
Fig.3 某重组蛋白疏水步骤纯化层析及电泳图
• 短链烷基配基（丁基、丁硫基等）：
疏水性较弱，适合疏水性较强或稳定性较差的蛋白，避免结合过强导致洗脱困难或活性下降。
• 长链烷基配基（辛基等）：疏水性中等偏强，适合疏水性中等的蛋白，通过增强结合力提高分离效率。
• 芳香族配基（苯基等）：疏水性最强，除疏水作用外，还可能参与π–π相互作用，对疏水性较弱、易流穿的蛋白尤其有效。
• 促结合盐选择（Hofmeister 序列由强到弱）：硫酸铵 > 硫酸钠 > 氯化钠
• 常用浓度：
○ 上样/平衡：1.0~1.5M硫酸铵（部分工艺可用至2.0M增强结合）。
○ 洗脱：线性降盐或阶梯降盐浓度至接近0M。
注意：盐浓度过高会增加溶液黏度、提升运行压力，并在进柱端引发沉淀风险。
• 建议范围 pH 6–8：保持蛋白构象稳定，减少极端pH对配基和基质的化学损伤。
• 对于构象敏感或易聚集的蛋白，可在洗脱缓冲液中添加温和助溶剂（如甘油、乙二醇）提高稳定性。
疏水作用层析凭借高选择性、温和洗脱条件、特定杂质的高效清除能力，已成为重组蛋白纯化流程中不可替代的单元操作。
1. 对活性保持要求高且能耐受高盐条件的酶、抗体等分子。
2. 电荷性质与杂质接近、难以通过IEX区分的蛋白。
3. 需要高效去除聚集体、疏水性HCP的工艺。
4. 盐析或高盐预处理后直接捕获目标蛋白。
通过合理选择配基、精确设定盐种类与梯度，结合pH等条件优化，并与AEX/TFF等单元操作协同设计，能在重组蛋白工艺中实现更稳健的纯度与回收率平衡。
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