抗体偶联药物（Antibody–drug conjugates，ADCs）被誉为肿瘤治疗的“生物导弹”，通过抗体靶向肿瘤细胞，精准释放细胞毒性载荷，极大提升了疗效并降低系统毒性。自2000年首款ADC药物Mylotarg上市以来，全球已有超17款ADC药物获批（截至2024年），覆盖血液瘤和实体瘤，市场估值超百亿美元。而ADC的复杂结构对生产工艺提出了极高要求，本文将深入剖析ADC下游纯化的策略、技术难点及对应的解决方案。
生物制品工艺开发的核心目标在于构建稳健可控的生产工艺体系，确保可重复制备出符合预设质量属性的产品。
对于传统非抗体偶联药物（Non-ADC biologics），其关键质量属性（Critical Quality Attribute, CQA）包括可能影响临床安全性与有效性的关键指标，如产品大小相关变异体（如聚集体、片段）、电荷异质性、氧化变体等，工艺相关杂质（宿主细胞蛋白、DNA残留）、浓度、活性等。
而ADC由于兼具生物大分子与化学小分子的双重特性，还需额外关注其他质量属性，包括药物抗体比率(Drug-to-Antibody Ratio, DAR)，DAR值的分布、游离毒素残留、偶联反应溶剂残留等。
• DAR值以及DAR值的分布：其直接影响了药物的有效性与安全性，生产工艺必须确保DAR值以及分布的批间一致；
• 游离毒素：作为高风险工艺相关杂质，这类未偶联小分子因缺乏靶向递送机制，无法特异性作用于靶点，未能提升疗效，可能引发全身毒性风险；
• 偶联反应溶剂残留：工艺开发需同步关注偶联反应体系中引入的有机溶剂（如DMF、DMSO）、还原剂（如TCEP）等工艺相关杂质的清除效率，确保终产品符合质量属性放行要求。
在偶联反应之后，通常存在游离毒素和溶剂，因此需要去除相关杂质。UF/DF是缓冲液交换生物制品的常用方法。选择合适截留孔径的UF/DF膜，可在保留产品的同时有效去除许多低分子量杂质，包括潜在的溶剂、游离毒素等相关杂质。如Fig.1所示，理想情况下UF/DF能够有效将偶联反应后的所有杂质去除至可接受水平的情况下。
Fig.1 UF/DF杂质清除随透析体积变化的情况
(A) 残留溶剂 (B) 游离药物
对于部分ADC，游离毒素和游离毒素相关杂质可能无法通过UF/DF被清除。Fig.2显示了在使用30 kDa膜进行UF/DF过程中，两种分子量均小于2 kDa的游离药物相关杂质的清除行为。杂质A可通过UF/DF膜并在此步骤中被清除超过2 log，而杂质B在经历10个透析体积的过程中并未显著被清除。但这可能部分是由于毒素自我聚集，从而在水环境中增加其表观尺寸，或游离毒素与ADC之间的非特异性相互作用。
• 如UF/DF无法将游离毒素及相关杂质清除至可接受水平，则需要采用层析纯化步骤；
• 如偶联反应产生不可接受水平的产物变体或聚集体，则需对ADC进行层析纯化。
Fig.2 UF/DF杂质清除随透析体积变化的情况
(A) 残留溶剂 (B) 游离药物
结合-洗脱色谱法作为一种常规分离技术，可有效实现ADC中游离毒素的去除。该方法基于ADC与游离毒分子间显著的理化特性差异，通过选择性吸附实现高效分离。
在阳离子层析工艺中，采用低电导、酸性上样条件下，ADC（裸抗等电点通常较高）带正电，被填料牢固结合。而绝大多数游离毒素分子量小、电荷中性或负电，无法结合，随穿透峰被直接去除。如Fig.3所示的典型图谱，通过上样穿透和平衡缓冲液淋洗，游离毒素含量可从52.2%显著降至5.0%。
Fig.3 阳离子交换层析纯化图谱
• 难点：部分疏水性强的毒素可能与填料或ADC发生非特异性吸附，导致清除不全。
• 解决方案：筛选不同配基的阳离子填料；
在淋洗缓冲液中添加低浓度的有机溶剂或表面活性剂。
ADC产品工艺的复杂性，决定了其在偶联工艺结束后可能会导致聚集体含量升高至不可接受的水平，因此在偶联后引入纯化步骤可能是必要的，以确保该工艺能够满足所需产品质量要求。对此可采用阳离子结合-洗脱色谱法，可有效实现ADC中聚集体的去除。如Fig.4 所示，该方法基于聚集体与单体的理化特性差异实现高效分离。
Fig.4 阳离子交换层析聚集体去除结果
由于不同DAR值的ADC具有不同的疏水性，因此，可用疏水层析对其DAR值进行控制。如Fig.5 所示，DAR 0 化合物具有低疏水性，通常无法被捕获，上样过程中流穿，DAR 1、DAR 2 的ADC被HIC捕获，并在梯度过程中被依次洗脱洗脱。
Fig.5 疏水层析分离不同DAR值的ADC
ADC由于兼具生物大分子与化学小分子的双重特性，其纯化需在去除传统杂质的基础上，还需去除游离毒素、偶联反应溶剂残留以及控制DAR值及其分布等。
为实现上述目标，下游工艺需采用多种纯化策略：
• UF/DF实现快速缓冲液交换并去除大部分的小分子杂质；
• 通过阳离子交换层析（如Diamond CD-S，具有高载量，良好的有机溶剂耐受性）依据电荷差异，实现游离毒素的清除及聚集体的有效去除；
• 借助疏水作用层析（HIC）依据不同DAR值ADC分子疏水性的差异，进行精细分离，从而精确控制DAR值及其分布。
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