起底非特异性吸附

2026,03, 27

博格隆

在生物制药层析工艺中，非特异性吸附（Non-specific Binding, NSB）常被视为难以捉摸的工艺干扰。非特异性吸附是目标蛋白与填料非预期位点的结合、非目标蛋白与填料的非预期结合的统称，二者均会引发工艺问题。其典型表现有：目标蛋白收率异常下降、洗脱峰拖尾、杂质清除率波动等。要真正解决非特异性吸附，必须跳出简单的表面现象，深入到分子热力学与填料-蛋白质界面动力学的层面。

分子热力学分析

传统观点认为，非特异性吸附是蛋白质分子与填料的“错误”结合。这种观点也不为错，因为这确实是非特异性结合的结果，也是我们在工作讨论中所用的行话。

但如果从更深层的物理化学视角看，在蛋白质样品流经层析柱时，样品溶液中一个个到处自由扩散的蛋白质，并没有长眼睛，根本不会“认识”所处的周围的填料是亲和型的，还是离子型的，抑或是多模式型的，更不会据此提前做好准备去结合填料。填料的这些分类，只是我们基于使用方便、结合一定的科学性给予的定义，样品中的蛋白质并不会提前知道我们用什么样的填料去吸附他们。那么，在本质上，蛋白质是怎么吸附到填料上的呢？

分子热力学告诉我们，特异性吸附本质上是目标蛋白质与填料特异性位点结合时，吉布斯自由能（ΔG）下降的体现。而同理，非特异性吸附的热力学本质为非目标蛋白与填料任意位点、目标蛋白与填料非预期位点结合时，吉布斯自由能（ΔG）下降的体现，二者均是体系自发的热力学过程。

另外，填料多位点吸附也会增加非特异性吸附的可能。如果在工艺上使用了较长的保留时间，蛋白分子表面可能会与某些填料形成多个位点的吸附。一旦蛋白质被填料上的多个吸附位点结合，那蛋白质的解离速率常数将会大幅下降。目标蛋白质在纯化层析图谱上表现为洗脱峰严重拖尾，或者根本无法被正常洗脱，导致洗脱体积增加或者收率下降（Lenhoff, 2011）；而非目的蛋白质的非特异性吸附增强，则会导致填料清洗困难，填料使用寿命缩短。

填料-蛋白质界面动力学分析

在更为宏观的层面上，非特异性吸附应视为蛋白质状态、填料-蛋白质界面、 溶液三者相互作用的结果。

◉ 蛋白质状态：表面电荷异质性与构象变化

• 蛋白质的等电点（pI）仅为宏观平均值。即使在 pI 以上，蛋白质局部强正电荷区域仍可与阴离子交换填料发生非预期的结合，也即非特异性吸附。

◉ 填料-蛋白质界面

不同填料基质在非特异性吸附方面的表现存在显著差异。

• 琼脂糖基质填料因具有天然多糖结构，其表面具备高度亲水性，使得基质本身对蛋白质分子的吸附能力极弱；同时，它在较宽的pH值和离子强度范围内，仍能稳定保持极低的非特异性吸附性能。正是这些特性，让琼脂糖基质通常表现出极低的非特异性吸附，也使其成为蛋白质纯化（尤其是单克隆抗体等大分子纯化）中最常用的基质之一。

• 而聚合物基质的填料，为了增加填料表面的亲水性，常常会在其表面做一些亲水性的修饰，而这些亲水修饰并非绝对安全。首先，亲水修饰可能不完全，导致填料上会残余一些官能团，这可能引起非特异性吸附；其次，表面亲水修饰看似解决了非特异性型吸附，却有可能使得填料局部的配基密度过高，从而造成非特异性吸附的增强。另外，部分聚合物基质孔径较小，蛋白质在填料孔内的传质受到空间位阻的影响，孔内的蛋白质浓度远高于样品中的浓度，蛋白质相当于被富集，这又会放大非特异性吸附作用（Müller, 1990; Lenhoff, 2011）。

◉ 溶液：离子效应

• 样品中的盐离子对蛋白质和填料的吸附作用遵循霍夫迈斯特序列（Hofmeister Series），有些类型的盐离子破坏水结构，另一些类型的盐离子增强疏水相互作用，从而改变蛋白-填料界面结合强度。

有效减少NSB的措施

关于减少蛋白质的非特异性吸附，目前已经有很多的研究。我们在日常的纯化过程，可以使用的措施有：

• 在缓冲液中加入合适的添加剂，如精氨酸、脯氨酸或0.1~0.5%非离子表面活性剂，提高蛋白质非特异性吸附发生的热力学阈值，防止非特异性吸附的发生。

• 在离子交换层析中，使用更高强度的缓冲液（如50mM代替20mM），防止填料表面处的pH波动诱导蛋白分子构象改变。

• 分步洗脱策略：如果是非目标蛋白的非特异性吸附，我们可以利用非特性型吸附组分与目标蛋白在解吸附动力学上的差异，通过调节pH和或盐梯度控制，进行分步洗脱提高纯度。

• 优化保留时间：在保证收率的前提下尽量缩短保留时间，防止非特异性结合变强。

结语

非特异性吸附在蛋白质纯化中并不罕见，我们在纯化过程中，可以对填料、溶液、添加剂等进行筛选，减少蛋白质非特异性吸附的发生，以减轻其对纯度、收率等关键质量属性和工艺性能的影响。